### 破骨细胞的诱导分化机制

破骨细胞是一类独特的多核细胞，起源于造血干细胞并通过巨噬细胞的分化形成，主要负责骨吸收过程。在这一机制中，RANKL/RANK/OPG信号通路作为破骨细胞分化的核心调控枢纽，通过精细调控破骨细胞与成骨细胞的活性平衡，从而维持骨骼的稳态。

RANKL（核因子κB受体激活因子配体）被视为促进破骨细胞成熟和增强其功能活性的关键因子。M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）可诱导RANK在破骨细胞前体的细胞膜上表达，促进这些细胞与RANKL结合，从而诱导破骨细胞分化。

由于破骨细胞在体内的数量较少，仅占分离细胞的0.8%-1.2%，且在体外分离和培养存在困难，目前常采取诱导方法。常用的诱导方法包括骨髓单核细胞诱导法和RAW264.7细胞系诱导法。

### 骨髓单核细胞诱导法

1. **小鼠处理**：选用8-12周龄的雄性C57BL/6J小鼠，采用CO₂吸入法处理后，将其浸泡于50mL 75%乙醇中进行消毒。
2. **取下小鼠后肢**：在无菌操作下，完整取下小鼠后肢，剔除股骨和胫骨上多余的皮肤与肌肉组织，并将骨头放入含有2%青霉素-链霉素的PBS溶液中（4℃预冷）。
3. **细胞分离**：使用含2%青霉素-链霉素的PBS溶液清洗胫骨和股骨，对于每块骨使用约8mL进行冲洗，确保无菌操作，避免污染。
4. **细胞提取与洗涤**：通过注射器将α-MEM灌入骨头，冲洗出骨髓细胞，并过滤至50mL离心管中，直至骨髓腔内红色残留消失。
5. **红细胞裂解**：用红细胞裂解缓冲液处理细胞，静置2-3分钟后，用含10% FBS的α-MEM培养基终止裂解，离心去除上清。
6. **细胞重悬与培养**：将细胞重悬于含20-50ng/mL M-CSF的培养基中，转移至培养皿中，在37℃、5% CO₂下培养。
7. **细胞贴壁与诱导**：当贴壁细胞达到80%-90%融合时，接种至含盖玻片的24孔板中，诱导培养并及时更换培养基。
8. **TRAP染色**：根据TRAP染色试剂盒说明书对细胞进行染色，观察TRAP阳性细胞以确认破骨细胞的形成。

### RAW264.7细胞系诱导法

1. **细胞培养**：常规培养RAW264.7细胞于含10% FBS的DMEM中，保持在37℃、5% CO₂的环境下，传代时应避免使用胰酶。
2. **细胞接种**：制备含10% FBS的α-MEM培养基，将细胞以2×10⁴ cells/孔的密度接种。
3. **添加RANKL**：在细胞接种后12小时，加入100-150ng/mL的RANKL。
4. **培养基更换**：每3天更换培养基，并补加RANKL以维持诱导效果。
5. **TRAP染色**：在4至6天后使用TRAP染色法鉴定破骨细胞。

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